CASCA DO COCO VERDE: FONTE DE TANINO PARA CONTROLE DE COLIFORMES

Genoilson de Brito Alves¹

Pedro Luiz Rodrigues Silva²

Milena Gonçalves de Oliveira³

Caroline Costa de Oliveira³

 Gabriela Thais Gonçalves³

 

¹ Biólogo, Mestre em Imunologia, Professor nos Cursos de Química e Meio Ambiente (alvesgbio@gmail.com)

² Engenheiro, Mestre em Físico-química, Professor do Curso de Química (pluiz@fei.edu.br)

^,3 Técnicas em Química (milena.mgo@gmail.com; carolineborgs@gmail.com; goncalvesbi@hotmail.com)

CEETEPS – Centro Estadual de Educação Tecnológica Paula Souza, ETEC Júlio de Mesquita

 

RESUMO

A utilização da casca de Cocos nucifera L., in natura para extração de agente ativo, proporciona uma metodologia viável e econômica.  A coleta para extração, evita o descarte inadequado em vias públicas e reduz o volume deste resíduo sólido em lixões e aterros, tornando-se uma alternativa sustentável. Em nosso cotidiano estamos constantemente expostos a microrganismos, alguns com grande potencial patogênico. A busca por novas formulações, para controle microbiano, pode amenizar a disseminação de infecções por estes patógenos. Profissionais na área de saúde, podem ser vetores de microrganismos devido a fixação destes nas vestimentas utilizadas. O emprego de taninos como agente antimicrobiano, mostrou-se eficiente no controle de bactérias Escherichia coli. A bactéria E. coli é uma importante bactéria para os parâmetros de qualidade ambientais em diversos setores, como indústria alimentícia, saneamento e recursos hídricos e para área de saúde. No ramo têxtil os microrganismos formam camadas que muitas vezes levam ao descarte da matéria prima ou do produto final.

 

Palavras-chave: Microrganismos, Cocos nucifera L., Tanino, Escherichia coli.

abstract

The use of Cocos nucifera L., in natura for active agent extraction, provides a viable and economic methodology. The collection for extraction, avoid improper disposal on public roads and reduces the volume of solid waste in dumps and landfills, making it a sustainable alternative. In our daily lives we are constantly exposed to microorganisms, some with great potential pathogenic. The search for new formulations for microbial control, can mitigate the spread of infection by these pathogens. Professionals in health care, can be vectors of microorganisms due to fixing these in used clothing. The use of tannins as an antimicrobial agent, was effective in the control of bacteria Escherichia coli. The bacterium E. coli is important bacterium to environmental quality standards in various industries such as food industry, sanitation and water resources and health. In the textile industry the microorganisms forming layers which often lead to the disposal of the raw material or the final product.

Keywords: Microorganisms, Cocos nucifera L., Tannin, Escherichia coli.

Introdução

Estima-se que o Brasil possui uma área plantada de 100 mil hectares de coqueiro-anão, destinados à produção do fruto verde para o consumo da água de coco.  As cascas geradas por este agronegócio representam de 80% a 85% do peso bruto do fruto, e cerca de 70% de todo lixo gerado nas praias brasileiras (ROSA et al., 2001). O aumento na produção e no consumo da água de coco, tem gerado cerca de 6,7 milhões de toneladas de casca/ano, gerando um sério problema ambiental, sobretudo para as grandes cidades, dado que cerca de 80% a 85% do peso bruto do coco verde é considerado lixo (MACHADO; DAMM; JUNIOR, 2009).

Normalmente este material gerado é conduzido para aterros, podendo gerar gases do efeito estufa, entre outros, durante sua decomposição.  Os taninos podem ser extraídos da casca de várias espécies florestais, sendo amplamente distribuído entre as plantas, e na casca de algumas espécies, sua concentração pode atingir até 40%, favorecendo assim a sua exploração comercial (PASTORE JÚNIOR, 1977). Historicamente, os taninos foram utilizados para curtir couro, atualmente são aplicados em produtos farmacêuticos, corante corporal, na fabricação de plásticos, fungicidas, bebidas, velas e panelas de barro, às quais dão a coloração preta e são também responsáveis pela sua impermeabilização (RAYGORODSKY, 2005). Os extratos tanantes vegetais também possuem utilidades como floculantes / coagulantes, como agentes de suspensão, dispersantes e fluidificantes para lama de perfuração e como adesivos para a indústria da madeira (TANAC, 2006).

O mecanismo de ação antimicrobiano dos taninos explica-se por três hipóteses: 1) os taninos poderiam inibir enzimas bacterianas e fúngicas e/ou se complexar com os substratos dessas enzimas; 2) ação dos taninos sobre as membranas celulares dos microrganismos, modificando seu metabolismo; 3) na formação de complexos com íons metálicos, diminuindo a disponibilidade de íons essenciais para o metabolismo microbiano (SCALBERT, 1991).

Taninos são compostos secundários, que podem variar em concentração nos tecidos vegetais, dependendo da idade e tamanho da planta, da parte coletada, da época ou, ainda, do local de coleta (TEIXEIRA et al., 1990; SIMÓN et al., 1999; LARCHER, 2000).

Os taninos hidrolisáveis compreendem os taninos gálicos e os taninos elágicos. Os primeiros decompõem-se em ácido gálico e açucares, quando submetidos a reações de hidrólise, enquanto o segundo forma ácido elágico e açúcares sob as mesmas condições (PIZZI, 1983).

Os taninos condensados (figura 1) são formados por unidades de flavonóide (flavan 3-4 diol e flavan 3-ol) em vários graus de condensação (dependem do tipo e da origem do tanino), não sofrem hidrolise e se precipitam com formaldeído e ácido clorídrico, segundo a reação de Stiasny (WISSING, 1955).

 

 

	a)      flavan 3-4 diol

 

 

	b) flavan 3-ol

 

 

 

 

Figura 1 - Estrutura de taninos condensados (FERREIRA, 2004).

                                                                                               

Os taninos condensados constituem mais de 90% da produção mundial de taninos comerciais ultrapassando a marca de 350.000 toneladas/ ano (GUANGCHENG et al., 1991). A oferta de matéria prima através de descarte e as possibilidades de aplicação científica e industrial, tornam a exploração do tanino uma alternativa viável e econômica, além de ser uma proposta sustentável para minimizar os impactos e gerar renda em diversas localidades costeira.

 

 

Material e Métodos

 

Coleta e Preparação do Material

 

As cascas de Cocos nucifera L. foram coletadas em uma lanchonete localizada na rua Presidente Carlos de Campos, centro de Santo André. Após a coleta, trituramos as amostras e separamos as fibras do pó da casca e este último fora colocado em estufa a 60ºC até atingir peso constante.

 

 

Extração de tanino

 

Há várias metodologias para a determinação de teor de taninos. Utilizou-se uma adaptação da metodologia, que trata da determinação do teor de taninos em base seca, proposta por Trugillho et al. (1997).

 

Extração em Água Quente

 

Preparou-se 10g de amostra composta que foi colocada em erlenmeyer de 500 mL, sendo adicionados 250 mL de água destilada. A amostra foi submetida à extração em água quente, em manta aquecedora com condensador de refluxo com o objetivo de promover a condensação do vapor d’água no interior do erlenmeyer mantendo, assim, o volume inicial de água e evitando perda excessiva de produtos nos extrativos por volatilização e arraste pelo vapor d’água. Foi realizada a extração por 2 horas de fervura. O extrato obtido foi posto em Becker de 500 mL e coberto com papel alumínio, para evitar contaminação e perda por volatilização do material. Após as extrações, realizou-se secagem da fração sólida (fibra + pó) em estufa a 65°C até atingir peso constante. A partir do peso inicial da amostra e do peso seco após extração foi possível determinar o teor de extrativos totais em água quente que foi usada a seguinte equação:

 

 

TEA = P_i – P_fx 100

P_f

Onde:

TEA é o teor de extrativos em água quente, em porcentagem;

P_i é o peso inicial da amostra (10g) e;

P_f é o peso seca em estufa, após as extrações em grama.

 

 

Determinação do Conteúdo em Taninos Condensados

 

Para a determinação do conteúdo em taninos condensados foi utilizada a metodologia apresentada por Doat (1978).

O método consiste em se retirar uma amostra de 50 ml do extrato total, a qual é adicionado 5 ml de formaldeído P.A e 2,5 ml de ácido clorídrico concentrado, deixando-se descansar por um período de 24 horas. À reação do formaldeído com o tanino produz a polimerização através de pontes metilênicas que ocorrem nos sítios reativos das moléculas do flavonoide, principalmente nos anéis aromáticos, tendo como produto um precipitado polimérico (PIZZI & MITTAL, 1994). Assim, o precipitado foi filtrado em papel de filtro quantitativo com auxílio de bomba à vácuo, posto para secagem em estufa a 65°C até atingir peso constante, e pesado, obtendo-se assim o número de Stiasny. Para obter a porcentagem de taninos condensados na solução é preciso determinar primeiramente o teor de sólidos totais presentes no extrato.

O teor de sólidos totais foi determinado por:

     TST = PS x 100

                                  PU

 

Onde,

TST é o teor de sólidos totais, em porcentagem;

PS é o peso da alíquota seca;

PU é o peso inicial da alíquota.

 

A determinação do teor de sólidos totais presentes no extrato deu-se pela pesagem de uma amostra de 100mL de extrato e obtenção do peso após secagem. Com base no teor de sólidos totais e no número de Stiasny, foi possível determinar o teor de taninos condensados no extrato. Em seguida, obteve-se o teor de taninos condensados em base seca.

Assim, o teor de taninos condensados foi calculado da seguinte maneira:

 

TTC = Nº STIASNY x 100

TST

 

Onde,  TTC é o teor de taninos condensados na solução, dado em percentagem,

N° STIASNY é o peso de tanino condensado na solução em gramas;

O teor de taninos condensados, base a casca seca, foi determinada por:

 

TCC (%) = TEA x TTC

100

 

Em que,

TCC é o teor de taninos condensados na casca, dado em percentagem;

TEA é o teor de extrativo totais em água quente, em percentagem e;

TTC é o teor de taninos condensados na solução.

 

Aplicação do tanino em tecidos

 

É necessário o tratamento do tecido para que esse adquira caráter catiônico para que seja possível a fixação de taninos aniônicos. Dessa forma, é necessária a aplicação do sal quartenário de amônio no tecido com o objetivo de oferecer a ele caráter catiônico para que possa haver afinidade entre o composto e o material a ser protegido contra microrganismos e os taninos.

Foram pesados 0,5g de tecido e realizou-se o “cozimento” do mesmo por 10 minutos em água a 60ºC. Posteriormente, foi pesada a mesma massa de sal quartenário de amônio que havia sido cozinhada de tecido, metade de sulfato de sódio e 4g. de solução tanante. As substâncias foram diluídas em 100mL de água. Após o “cozimento”, o tecido foi colocado na solução de amônio à 60ºC durante 10 minutos. Em seguida, foi submetida à solução de tanino mais sulfato de sódio que atua como fixador, por 15 minutos à 80ºC. O tecido foi lavado em água por 3 minutos à 60º e por 3 minutos em água fria.

 

Análise microbiológica

 

O teste de sensibilidade dos microrganismos em relação ao tanino foi realizado a partir de meios de cultura e contagem do número de células em câmara de Neubauer, citados por TORTORA (2004).

 

Isolamento de Escherichia coli

 

Para termos a confirmação da espécie das bactérias utilizamos ágar MacConkey onde isolamos as colônias de coloração rosa e com produção de gás, que é característico de E. coli A produção de gás com estufamento do meio é indicativo de fermentação da lactose presente no meio. As amostras foram centrifugadas a 2000 rpm durante 5 minutos. Descartamos o sobrenadante e o pellet foi condicionado em caldo nutriente.

 

 

Contagem em câmara de Neubauer

 

Pipetamos 50µL da amostra original em 150 µL de meio. A amostra diluída foi pipetada em dois campos da câmara de Neubauer onde executamos a contagem das bactérias e submetemos à contagem a fórmula: número de células X diluição X volume final X 10⁴. Após a contagem separamos 1.3X106 células bacterianas de E. coli para os procedimentos experimentais.

 

Avaliação do papel inibidor do tanino em culturas de Escherichia coli  in vitro

 

Pipetamos 1.3X10⁶ bactérias E. coli em poços da placa de ELISA em um volume de 50µL, mais 50µL de meio de cultura em cada poço e 100µL de extrato da casca de Cocos nucifera L. com concentração tânica de 0,72 g/L e em diferentes diluições de 0,371 g/L, 0,185 g/L e 0,092 g/L para obtermos os parâmetros: 1:1, 1:2 e 1:4.

 

Avaliação do papel inibidor do tanino fixado em tecido de algodão

 

A fim de testar o real efeito antimicrobiano dos taninos, foram fixados em tecidos amostras tânicas comerciais de ácido tânico - tanino hidrolisável e WEIBULL BLACK - extrato da mimosa puro e natural com alto teor de taninos condensados desenvolvido pela TANAC S.A., usado para controle experimental.

Outras porções de tecidos foram testadas com extratos tânicos de Cocos nucifera L., fixados e um pedaço de tecido sem proteção, para controle.

Todas as amostras de tecidos foram sobrepostas em meios de cultura ágar nutriente com número de células inoculadas quantificadas em Câmara. As placas foram mantidas em estufa a 38°C por 48 horas.

 

Análise estatística

 

            A análise estatística foi obtida através do teste One-way ANOVA, seguido por análise do Teste de Bonferroni. Todas as análises estatísticas foram realizadas através do Software GraphPad 5. Os asteriscos acima das linhas representam as diferenças significantes entre as barras indicadas com *p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001.

 

 

RESULTADOS E DISCUSSÃO

 

A extração de taninos da casca de cocos nucifera L., em água quente é eficiente devido à solubilidade das substâncias em solventes polares, porém, o desenvolvimento das extrações dessa maneira torna difícil a obtenção de uma solução tânica totalmente pura, pois diversos componentes constituintes da matéria prima também são solúveis em água.

Deste modo, uma extração com 10,87 gramas de casca, foi possível obter concentração de sólidos totais em água de 32 g/L e de taninos de 0,72 g/L.

Ao desenvolver a metodologia de extração de taninos em água quente, é possível observar que esta é economicamente viável por utilizar um solvente de baixo custo, além disso, o tempo de extração é favorável, diminuindo custos e resíduos que poderiam causar danos ao meio ambiente.

Testes microbiológicos in vitro

Para Verificarmos a eficácia do tanino como agente antimicrobiano, foram realizados ensaios in vitro. Utilizamos bactérias Escherichia coli, por ser a bactéria padrão entre os coliformes fecais, portanto, alvo de pesquisas em diversas análises ambientais. Realizamos um ensaio desafiando 1.3X10⁶ bactérias com diferentes concentrações de tanino.

As bactérias foram cultivadas em estufa por 48h em meio de cultura MacConkey, à 36ºC. Pipetamos 1.3X10⁶ bactérias em poços da placa de ELISA e incubamos por uma hora com caldo nutriente, tanino puro e com as proporções de tanino: caldo nutriente obtendo as diluições 1:1, 1:2, 1:4. Observamos que a concentração de tanino influencia diretamente na proliferação bacteriana.

          Após a incubação as amostras foram transferidas para placas de Petri contendo meio de cultura e condicionadas à 36ºC por 48h. Após o tempo de cultura mensuramos o diâmetro do crescimento microbiano na placa e comparamos com o controle (Figura 2).

 

Figura 2. Inibição bacteriana pela concentração de tanino. Os asteriscos acima das linhas representam as diferenças significantes entre as barras indicadas com (*p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001).

 

Com base nos resultados obtidos, a presença de tanino na cultura restringiu a proliferação bacteriana quando comparados com o controle. Verificamos que mesmo a menor concentração testada ainda apresentou diferença estatística em relação ao controle.

A solução tanante proveniente do extrato de Cocos nucifera L. mostrou-se muito eficiente, uma vez que a mesma estava em concentração e grau de pureza relativamente baixo. Desta forma podemos inferir que a utilização de uma solução mais concentrada desencadeará um controle maior sobre a proliferação bacteriana.

 

Efeito antimicrobiano dos taninos aplicados em tecidos.

 

A avaliação da ação inibitória dos taninos em tecidos foi analisada a partir da comparação entre tecidos com diferentes tipos de taninos em meio de cultura expostos a Escherichia coli.

 

Tabela 1. Relação do tempo extração e fixação nos tecidos.

*Tecido 5 se trata do Ácido Tânico - tanino hidrolisável. Tecido 6 do WEIBULL BLACK - produto cedido pela empresa TANAC S.A. com grande concentração de taninos condensados.

 

A partir da análise realizada e dos dados da tabela 1, é possível demonstrar que a solução tânica foi mais eficiente quando aplicada recentemente aos tecidos, e ainda quando esta é extraída pouco tempo antes de sua aplicação no tecido, ou seja, a eficiência se dá pelo tempo de extração e fixação no tecido.

No tecido com extrato tânico obtido da casca de Cocos nucifera L. uma semana antes da fixação e duas antes do teste (tecido 2), não houve halos de resistência, enquanto que no tecido em que foi aplicada a mesma solução, porém um dia antes do início do teste (tecido 3), observamos um pequeno halo de inibição de 0,5 mm (além da área de contato do tecido).

Em outro tecido (tecido 4), foi aplicada uma solução tânica extraída da casca dois dias antes do teste e fixada no dia anterior, e neste foi possível mensurar um halo de inibição de 3,6 mm (Figura 3).

Os tecidos com as amostras tânicas comerciais mostraram grande resistência frente a proliferação de E. coli. Os halos de inibição de 9 e 21mm, da amostra de tanino condensado da TANAC e ácido tânico (hidrolisável), respectivamente (Figura4).

Figura 3. Antibiograma com extratos aplicados em tecidos

 

 

 

Figura 4. Medida dos Halos de inibição formados com tecidos. Os asteriscos acima das linhas representam as diferenças significantes entre as barras indicadas com (*p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001).

 

REFÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

DOAT, J. LesTaninsdansles bois Tropicaux. Revue Bois etFlorêtdes Tropiques. Nogent, n. 182, p. 37-35, Nov/Dec 1978.

 

FERREIRA, E. S. Utilização dos polifenóis para produção de adesivos para compensados. Dissertação (Mestrado em Ciências Ambientais e Florestais), Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro, Seropédica – RJ, 2004, 79p.

 

GUANGCHENG, Z. ; YUNLU, L. ; YAZAKI, Y. Extractive yields, Stiasny values and polyflavonoid contents in barks from six acacia species in Australia. Australian Forestry, Queen Victoria, v. 554, n. 2, p. 154-156, 1991.

 

MACHADO, K. C.; DAMM, D. D.; JUNIOR, C. C. M. F. Reaproveitamento tecnológico de resíduo orgânico: casca de coco verde na produção de gabinetes ecológicos de computadores, In: Fórum Internacional de Resíduos Sólidos, 2. Porto Alegre, 2009.

 

PASTORE JUNIOR, F. Produção de adesivos à base de tanino. Comunicação técnica n°19, PRODEPEF, Brasília, BR, 1977.

 

RAYGORODSKY, B.; Uma panela que virou um prato. Disponível em: http://basilico.uol.com.br/viajar/viajar_vg_003.shtml. Consultado em: 04/1/13 . Publicado em: 17/02/2005.

 

ROSA, M. de F.; ABREU, F. A. P. DE; FURTADO, A. A. L.; BRÍGIDO, A. K. L.; NORÕES, E. R. de V. Processo agroindustrial: obtenção de pó de casca de coco verde. Fortaleza: Embrapa Agroindústria Tropical, 2001. 3p. (Comunicado Técnico, 61).

 

SCALBERT, A. Antimicrobial properties of tannins. Phytochemistry, Chichester, v.30, n.12, p.3875-3883, 1991.

 

TEIXEIRA, M. L. ; SOARES, A. R. ; SCOLFOR, J.R.S. Variação do teor de tanino da casca de barbatimão [stryphnodendronadstringens (Mart.) Covillej em 10 locais de Minas Gerais]. Ciência Prática, v. 14, n.2, p.229-232, 1990.

 

PIZZI, A.; MITTAL, K. L. Handbook of adhesive technology. New York: Marcel Dekker, 1994. 680p.

 

PIZZI, A. Wood adhesives: chemistry and technology. New York: Marcell Dekker, 1983. 364p.