A COLUNA DE WINOGRADSKY NA FORMAÇÃO PRÁTICA DOCENTE: UMA ABORDAGEM INVESTIGATIVA PARA O ESTUDO DE COMUNIDADES MICROBIANAS

Renata Cruz Maciel ⁽¹⁾; Iara Cecília da Costa Morais ⁽²⁾; Lidiane Medeiros de Andrade ⁽³⁾; Karina Rayne da Silva ⁽⁴⁾; Anderson Pereira da Costa ⁽⁵⁾, Magnolia Fernandes Florencio de Araujo ⁽⁶⁾

⁽¹⁾ Estudante de Ciências Biológicas; Departamento de Microbiologia e Parasitologia; Universidade Federal do Rio Grande do Norte; renatacm_bio@hotmail.com; ⁽²⁾ Estudante de Ciências Biológicas; Departamento de Microbiologia e Parasitologia; Universidade Federal do Rio Grande do Norte; iaracecilia_@hotmail.com; ⁽³⁾ Estudante de Ciências Biológicas; Departamento de Microbiologia e Parasitologia; Universidade Federal do Rio Grande do Norte; lidinatal@hotmail.com; ⁽⁴⁾ Estudante de Ciências Biológicas; Departamento de Microbiologia e Parasitologia; Universidade Federal do Rio Grande do Norte; kell_rayne@yahoo.com.br; ⁽⁵⁾ Estudante de Ciências Biológicas; Departamento de Microbiologia e Parasitologia; Universidade Federal do Rio Grande do Norte; andersonbiology@hotmail.com; ⁽⁶⁾ Professor adjunto de Microbiologia; Departamento de Microbiologia e Parasitologia; Universidade Federal do Rio Grande do Norte; Av. Senador Salgado Filho, Lagoa Nova, 59072-970, Natal/RN;.

 

RESUMO: O processo de ensino-aprendizagem se mostra complexo e abstruso no que diz respeito ao ensino em microbiologia, justamente por ser uma ciência onde é de difícil visualização desses seres vivos, e muitas vezes as aulas se tornam monótonas e desestimulantes para muitos alunos quando não são ministradas de forma mais ativas, sem o uso de práticas e recursos tecnológicos. Através da disciplina de microbiologia do curso de ciências biológicas da Universidade Federal do Rio Grande do Norte foi proposta a realização de um projeto com base na construção de uma coluna de Winogradsky, onde é possível simular as condições ambientais similares às encontradas na natureza em que muitos microrganismos vivem, e a partir disso embolsar mais conhecimento a cerca das comunidades microbianas e relacionar o ambiente em que vivem com suas capacidades metabólicas. O presente trabalho trouxe grande contribuição para os alunos licenciandos, e mostrou que é possível adaptá-lo para aulas do ensino básico.

Palavras-chave: Coluna de Winogradsky, ensino, microbiologia.

 

 

 

 

 

INTRODUÇÃO

Através da disciplina de microbiologia do curso de Ciências Biológicas da Universidade Federal do Rio Grande foi proposto um projeto que no decorrer de oito semanas foram feitas observações de uma coluna, simulando a coluna de Winogradsky ao qual foi criada em 1880, é um modelo bastante didático-pedagógico podendo ser eficaz na utilização do estudo de microrganismos aquáticos e sedimentares. A coluna mostra um pequeno ecossistema fechado composto por água, solo, este podendo ser proveniente de diversos ambientes como praia, mangue, lagoas, e rico também em nutrientes que com o passar do tempo espera-se observar o aparecimento de microrganismos e assim poder compreender o papel de cada um deles na coluna e nas camadas ao qual pertencem.

 

 

A coluna de Winogradsky é um modelo interessante que simula as condições de ecossistemas naturais, na qual desenvolve de populações bacterianas fotossintéticas que utilizam o sulfeto de hidrogênio como doador de elétrons durante o metabolismo foto autotrófico, onde é possível observar as sucessões microbianas em um ambiente aquático, uma vez que as microbiota presente se modificam ao longo do tempo e sob a ação dos fatores ecológicos que atuam nesta comunidade. (GOMES; OSÓRIO, 2011)

 

 

 

O Objetivo do nosso trabalho é destacar a importância de uma atividade prática na formação de futuros docentes e que as práticas também podem ser aplicadas nas aulas do ensino básico. Bem, como relato de Mizukami (2002, p. 167) “Como um caminho para o aprimoramento da prática e a formação dos professores, por ajudar a refazer o caminho trilhado possibilitando descobrir acertos e erros, e tentar construir novos rumos para a atuação, quando necessário”.  É possível que essa atividade seja aplicada em uma prática de investigação para os estudantes do ensino básico, e Leite (2005) já relata que as aulas práticas no ambiente de laboratório podem despertar curiosidade e, consequentemente, o interesse do aluno, visto que a estrutura do mesmo pode facilitar, entre outros fatores, a observação de fenômenos estudados em aulas teóricas.

 

 Compreender a grande importância de fazer uso dessa prática de investigação, no qual é um sistema que simula a condição bem próxima a existente na natureza é de grande enriquecimento não só para futuros docentes mais também como um auxilio para os que já estão atuando na área da licenciatura.

 

METODOLOGIA

 

O projeto foi desenvolvido no laboratório de microbiologia da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, no período do primeiro semestre do ano de 2014 com inicio no dia 12 de fevereiro e término das observações no dia 14 de maio sob o acompanhamento da professora Magnólia Fernandes Florencio de Araújo. O experimento seguiu as seguintes etapas:

 

1-    Escolha do local que forneceu o sedimento e a água para construção da coluna Winogradsky

 

A escolha do material para a construção da coluna foi o mangue, pois é um local que se espera uma grande diversidade de microrganismos.

  A amostra do sedimento e de água foi retirada do mangue pertencente ao Rio Potengi na cidade de Natal (Fig.2) no dia 12 de fevereiro sendo o horário aproximado da coleta oito horas da manhã. O material foi armazenado em depósitos de plásticos de um quilo cada um, como mostra a figura abaixo. (figura 1)              

                                        Figura 1: A) sedimento, B) água

        

      

Figura 2: Local da coleta (setas) mangue do rio Potengi Natal/RN

 

2-    Confecção da coluna Winogradsky com material coletado

 

A construção da coluna iniciou com a mistura do sedimento retirado do mangue, cerca de 500 gramas com uma quantidade de papel picado (como fonte de carbono) e em seguida foi adicionada uma colher de chá rasa de sulfato de cálcio e de carbonato de cálcio. No segundo momento, após a mistura ser bem triturada, foi depositado todo o sedimento em uma proveta de vidro de 1000 ml e logo após, a água do mesmo local da coleta. A última etapa foi limpar a proveta e cobrir a coluna com uma película plástica transparente e deixada exposto em um ambiente com luz. (fig.3)

 

 

 

Figura 3: Coluna de Winogradsky pronta para o desenvolvimento microbiano

 

 

3-    Após a coluna pronta

 

Após a construção da coluna de winogradsky foram feitas análises e observações orientadas pelas seguintes questões:

a)    A cor do sedimento mudou? Se assim for, anotar a cor.

b)    A cor da água mudou? Se assim for, anotar a cor.

c)    O sedimento parece ter assentado? Ele Mudou?

d)    Você vê algumas camadas se formando no sedimento.

e)    A espessura das camadas muda de semana a semana? Como?

f)     Fotografar.

g)    Faça um desenho esquemático da coluna de três em três semanas.

 

4 - Términos das observações

 

No final de todas as observações a coluna foi desfeita e realizados alguns testes bioquímicos para investigar e compreender a capacidade metabólica dos microrganismos, considerando sempre o seu papel no ambiente em que estão inseridos. Utilizamos o manual de Bergey, que é uma obra e referência oficial da taxonomia de bactérias, para assim associar as informações umas às outras e compará-las com as do manual. Para a confecção da cultura de bactérias, foi retirada uma amostra da superfície líquida, outra porção da interface, ou seja, entre a parte líquida e o substrato e da porção mediana do substrato da coluna de winogradsky e colocado em placas de Petri com meio de cultura levemente opalescente, esperado sete dias para o crescimento das colônias. A escolha da colônia utilizada foi devido à mesma ter sido aparentemente a mais isolada das outras em questão. Os testes realizados foram:

Prova da Citocromo Oxidase

Esse teste ajuda a caracterizar espécies de não fermentadores baseado na produção intracelular da enzima oxidase pela bactéria. Para a prova foi espalhado a colônia a ser testada sobre a fita de oxidase e verificou-se se teve a mudança de cor.

Teste do vermelho de metila (VM)

Esse teste avalia se as bactérias fermentam a glicose pela via ácida mista, com a produção de vários ácidos abaixando o PH do meio. O indicador de pH é o vermelho de metila que em pH abaixo de 4,4 é vermelho e acima de 6 é amarelo. Para isso, foi adicionada uma amostra a ser avaliada em um tubo de ensaio e posteriormente foi adicionado quatro gotas do indicador, o tubo foi permutado gentilmente entre a palma das mãos e foi observado o resultado.

VP (Voges Proskauer)

Revela se a bactéria utiliza a fermentação butilenoglicólica. Para a realização do teste, também foi adicionado uma amostra da coluna em um tubo de ensaio. Foram adicionadas 10 gotas de alfa-naftol a 5% (catalisador), seguida de 0,2 mL de KOH a 40% (oxidante). Após 15 minutos observou-se o resultado.

Citrato

Este teste determina se a bactéria é capaz de utilizar o citrato de sódio como única fonte de carbono para o metabolismo e crescimento. Nesse teste, utilizaram-se tubos com meio inclinado para a cultura ter mais acesso ao oxigênio, que é necessário para utilização do citrato. Deve ser utilizado o meio Citrato de Simmons, contendo citrato de sódio, fosfato de amônia e azul de bromotimol. Com a facilidade do transporte de citrato pela citrato-permease há a sua utilização pela citrase, com produção de hidróxido de amônia que eleva o pH, fazendo com que a reação se torne azul. O CO₂ produzido reage com o sódio do citrato formando carbonatos de reação alcalina.

Fenilalanina – desaminase (teste FM)

Avalia se há a presença de bactérias que produzem enzimas que removem o grupo amina da fenilalanina, presente no meio, originando o ácido fenilpirúvico. A prova consiste na detecção de ácido fenilpirúvico após o crescimento do organismo testado. A prova é positiva se aparecer uma coloração verde após a adição de cloreto férrico a 10% (3 a 5 gotas).

Arginina/Ornitina – descarboxilação

Mede se as bactérias possuem a lisina descarboxilase (LDC) que atua sobre a porção carboxila dos aminoácidos, com formação de aminas, de reação alcalina (por exemplo: cadaverina), e CO₂. A reação ocorre preferencialmente em condições anaeróbias e ligeiramente ácidas, mas inicialmente ocorre a utilização da glicose do meio para enriquecimento da cultura e acidificação do meio. O meio contém o indicador bromocresol púrpura. Nas etapas iniciais de incubação, o tubo torna-se amarelo devido à fermentação da glicose. Se o aminoácido é descarboxilado o meio retorna à cor púrpura. A reação se processa em anaerobiose, podendo-se cobrir o meio com óleo mineral para agilizar o processo.

Provas do meio SIM (Sulfeto, Indol, Motilidade)

INDOL: O indol é produzido pela ação da triptofanase sobre o triptofano existente no meio de cultura, ocorrendo, também, a produção de ácido pirúvico e amônia. O indol pode ser detectado pela formação de um anel rosa na parte superior do tubo, após a adição de 3 a 5 gotas de p-dimetilaminobenzaldeído (reativo de Kovacs ou de Erlich).

Produção de H₂S

Algumas bactérias são capazes de degradar compostos contendo enxofre (como o tiossulfato de sódio e a cisteína das peptonas), através da tiossulfato redutase, produzindo H₂S que é incolor. Este reage com o ferro (indicador) formando um precipitado preto (sulfeto ferroso). Para que esta reação ocorra é necessário que o meio esteja ácido.

Motilidade

A motilidade é observada através do aspecto do meio SIM que, sendo semi-sólido, permite o crescimento bacteriano no interior do meio, por todo o tubo. Se a motilidade é positiva o aspecto do meio será turvo enquanto que, se for negativa o crescimento só será observado na zona da picada.

Uréia

Testa se existe bactérias que possuem a enzima urease que garante a capacidade de degradar a uréia presente no meio liberando amônia, CO₂ e H₂O. A amônia reage formando carbonato de amônia que alcaliniza o meio. O indicador de pH é o vermelho de fenol que em meio alcalino toma a coloração magenta. Uma coloração meio rosa é suficiente para considerar a reação positiva.

TSI – Triplo Açúcar Ferro

Este meio contém três açúcares: 0,1% glicose, 1,0% lactose, 1,0% sacarose, vermelho de fenol para detecção da fermentação de carboidratos e sulfato de ferro pra detecção da produção de sulfato de hidrogênio (indicado pela cor preta na base do tubo). A fermentação é indicada pela mudança da cor do indicador de pH de vermelho para amarelo.

Esquema 1: Interpretação do teste TSI

 

RESULTADOS

 

Após a análise da coluna de Winogradsky por oito semanas e aplicando as questões como base de orientação para mudanças morfológicas, foi feitas as observações seguintes.

Ao fazer a análise da coluna após uma semana não foi observado nenhuma mudança na coloração do sedimento, porém após duas semanas da realização da coluna, o sedimento apresentou manchas mais escuras do que a semana anterior, isto se deu pela fermentação das bactérias em contato com a fonte de carbono que foi o papel.

Em relação à coloração na água, na primeira semana foi possível observar mudanças, mostrando que estavam presentes três camadas, onde na base a cor era um pouco esverdeada, no centro transparente e na superfície mais esverdeada (Fig.4 A). Na segunda semana de observação houve mudanças novamente, desta vez apresentando apenas duas camadas, uma delas ainda com o tom esverdeado e a camada transparente estava apresentando mais turgidez (Fig.4 B). No decorrer de duas semanas como mostra na figura (Fig. 4 C) ocorreu mudança na coloração da água e o sedimento ficou mais firme e escuro.

 

Ao longo das observações percebemos que por algumas semanas não houve muitas mudanças como mostra a figura (5A), apenas nas ultimas semanas houve alterações na coluna de água, sem nova camada, mas uma coloração escura diferente das outras semanas e o sedimento com umas manchas no inicio próximo à superfície. (Fig.5B e 5C). Com todos esses resultados apresentados nesse curto espaço de tempo, podemos observar que a coluna de Winogradsky mostra de forma eficiente o crescimento microbiano simulando o que acontece naturalmente em um ecossistema.

 

Figura 4: Semanas de observações. A (1º Semana, mudança na coloração, 3 camadas na água mostrada nas setas); B (2º semana, 2 camadas  de água mostradas nas setas, cor turva, ); C( Duas semanas de observação,  mudança na coloração e apenas  1 camada na coluna de água).

Figura 5: Últimas Semanas de observação. A (não houve muitas mudanças comparadas com as outras semanas) B e C(coloração escura e aparecimento de manchas no início do sedimento mostradas pelas setas brancas).

Quanto ao meio de cultura escolhido:

            A placa que obteve maior número de colônias formadas foi à placa de Petri com amostra da interface onde, próxima da amostra retirada encontrava-se manchas. (Fig.5B).

Quanto aos testes bioquímicos realizados:

Prova da Citocromo Oxidase

Esse teste mostrou-se com o resultado negativo, tendo em vista que não houve mudança na coloração da fita, no local de inoculação das bactérias.

Teste do Vermelho de Metila (VM)

Nesse teste a resposta foi negativa, pois não houve a mudança para a coloração vermelha, e sim para amarelo com o meio podendo estar acima de Ph 6 demonstrando assim que não houve a fermentação de glicose pela via ácida mista.

VP (Voges Proskauer)

Após os 15 minutos, devido à adição dos componentes químicos observou-se a presença do anel vermelho tijolo, revelando assim um resultado positivo para bactérias fermentadoras butilenoglicólicas.

Citrato

As bactérias encontradas não são capazes de utilizar o citrato de sódio como única fonte de carbono para o metabolismo e crescimento, pois não houve a produção de hidróxido de amônia que eleva o pH, fazendo com que a reação se torne azul. O meio de cultura continuou com a sua coloração de origem, que era a verde.

Fenilalanina – desaminase (teste FM)

A prova foi negativa, pois não houve modificação na coloração do meio de cultura, não corroborando a detecção de ácido fenilpirúvico após o crescimento do organismo testado.

Arginina/ Ornitina – descarboxilação

As bactérias avaliadas possuem a arginina descarboxilase, podendo produzir o composto orgânico putrescina, revelando a coloração roxa, ou seja, para o teste a arginina foi positiva. Para a ornitina o teste foi negativo.

Provas do meio SIM (Sulfeto, Indol, Motilidade)

Indol: Mostrou-se negativo, não houve a formação do anel rosa.

Produção de H₂S: Não existiu a produção de H₂S, ausência de precipitado de coloração preta.

Motilidade: Bactérias são móveis devido o meio ter se mostrado turvo.

Uréia

As bactérias possuem a enzima uréase, exibiu a coloração magenta bem forte no meio de cultura.

TSI – Triplo Açúcar Ferro

No tubo de ensaio com o meio de cultura houve a formação de bolhas de gás, porção ácido-base na região superior do tubo, e sacarose positiva (meio de cultura com coloração amarela).

 

DISCUSSÃO

 

No decorrer das análises feitas, foi possível compreender que a distribuição dos micro-organismos na coluna estava de acordo com suas atividades metabólicas encontradas no meio, as mudanças de coloração provavelmente seria devido às atividades enzimáticas produzidas pelas bactérias. CARVALHO et al (2010) explica no seu trabalho que a coluna de Winogradsky é um sistema que permite demonstrar, de uma maneira simples, a enorme diversidade metabólica dos organismos procariotas. A forma como os microrganismos ocupam zonas altamente específicas de acordo com a sua tolerância ao meio envolvente (microambiente) e às fontes de energia e carbono disponíveis, é bem patente nesse sistema. Com as análises bioquímicas, podemos inferir que as bactérias encontradas são do gênero Enterobacter, mas não foi possível identificar quais espécies foram encontradas, mas podemos compreender e relacionar os dados a suas capacidades metabólicas.

Observou-se também que na coluna o maior cultivo de bactéria foi retirado na região da interface. De acordo com a literatura essa distribuição encontrada no final das observações pode apresentar característica semelhante descritas em outros trabalhos. Grant (1989 apud Gomes 2011) cita que a distribuição das bactérias oxidantes de enxofre, ao longo de uma coluna d’água, é relacionada com a concentração de sulfetos e oxigênio, bem como a disponibilidade de luz onde o sulfeto estará presente.

 

CONSIDERAÇÕES FINAIS E SUGESTÕES

 

            Através da construção da coluna de Winogradsky foi possível analisar a diversidade de microrganismos presentes em um ecossistema. Mesmo não sendo possível analisar todas as espécies foi fundamental para vários questionamentos realizados durante as observações, podendo fazer comparações do que ocorre no desenvolvimento microbiano em uma área de mangue.

 

            Além disso, a coluna mostra uma excelente ferramenta didática para ser trabalhada na área da educação ambiental com base na microbiologia, pois nela e possível observar quais microrganismos podem ser encontrados em uma determinada área e ao mesmo tempo comparar com ecossistema criado na coluna de Winogradsky.

 

Sugestão de Prática para ser realizada no ensino básico

 

Sabe-se que as aulas práticas contribuem grandemente com a aprendizagem e interesse dos alunos nas aulas de ciências e biologia, principalmente quando estas são problematizadas e investigativas. A coluna de Winogradsky pode ser construída de forma mais simples para ser aplicado no ensino básico substituindo os materiais de acordo com as condições no campo escolar.

 

Se o professor valoriza as atividades práticas e acredita que elas são determinantes para a aprendizagem de Ciências, possivelmente buscará meios de desenvolvê-las na escola e de superar eventuais obstáculos. As atividades práticas permitem aprendizagens que a aula teórica, apenas, não permite, sendo compromisso do professor, e também da escola, dar esta oportunidade para a formação do aluno. (ANDRADE; MASSABNI, 2011)

 

Cordeiro (2010) diz que a prática pedagógica constitui oportunidade de aperfeiçoamento, e foi isso que observamos com a execução dessa prática. Para facilitar a realização dessa experiência, o material pode ser coletado em uma área mais próxima da escola, a coluna pode ser feita com uma garrafa pet transparente e após o material pronto as análises e observações podem ser orientadas por outras questões de forma que possa contribuir com a curiosidade e conhecimento dos alunos, e no que eles esperam acontecer com o material produzido. No decorrer das observações, também poderão ser feitas mais de uma coluna onde uma delas pode ser armazenada em um local sem luminosidade, a fim de verificar se existirá a apresentação de alguma diferença entre ambas, a que está na presença da luz e a que está no escuro.

 

REFERÊNCIAS

ANDRADE, Marcelo Leandro Feitosa de; Massabni, Vânia Galindo. O Desenvolvimento de Atividades Práticas na Escola: hum Desafio parágrafo OS Professores de Ciências. Ciênc.. educ. (Bauru), Bauru, v.17, n. 4, 2011. Disponível a partir do 73132011000400005&lng=en&nrm=iso>. Acesso em 01 de junho de 2014. http://dx.doi.org/10.1590/S1516-73132011000400005.

 CORDEIRO.J. V; Prática pedagógica no processo ensino-aprendizagem: um estudo de caso na escola profissionalizante senac/concórdia, SC; B. Téc. Senac: a R. Educ. Prof ;Rio de Janeiro, v. 36, n.3, set./dez. 2010.

CARVALHO. S. A. etal; Detecção e caracterização de microrganismos sulfetogênicos no solo do ifbaiano campus catu: diagnóstico preliminar; Sistema de Gerenciamento de Conferências (OCS), V CONNEPI – 2010.

 

GOMES, Anderson; OSÓRIO, Lara dos Santos. Utilização da Coluna de Winogradsky para a Demonstração do Efeito dos Metais Pesados na Microbiota Oxidante de Enxofre em Ambientes Aquáticos: Uma Abordagem Experimental. Cadernos UniFOA. Volta Redonda, Ano VI, n. 16, agosto 2011. Disponível em: http://www.unifoa.edu.br/cadernos/edicao/16/21.pdf .

 

LEITE. S.C.A etal ; A importância das aulas práticas para alunos jovens e adultos: uma abordagem investigativa sobre a percepção dos alunos do PROEF II; Ensaio Pesquisa em Educação em Ciências, Vol. 7, No 3 (2005)

MIZUKAMI, M. da G. N. e outros. Escola e Aprendizagem da Docência: processos da Investigação e Formação. São Carlos: EdUFSCar, 2002, 203 p.MOREIRA, M. A Aprendizagem Significativa. Brasilia: Editora UnB, 1999